Począwszy od wynalezienia mikroskopu przez zespół ojca i syna, naukowcy byli zafascynowani powstającym nowym światem mikroorganizmów. Pojawienie się mikroskopu sprawiło, że badacze zapragnęli rejestrować swoje odkrycia, początkowo używając prostych, ręcznie rysowanych obrazów. To pragnienie doprowadziło w końcu do postępu w kinematografii i stworzenia krótkich filmów pokazujących ruch bakterii. Obecnie techniki obrazowania żywych komórek poszły o wiele dalej i umożliwiają rejestrowanie i badanie szczegółowych filmów wideo przedstawiających komórki i ich struktury.
Mikrokinematografia
Na początkuXX wieku naukowcy zaczęli szukać pomysłów na to, jak rejestrować żywe komórki w rozwijającym się przemyśle filmowym. Jednak pierwszy znaczący wkład naukowy wniósł około 1910 roku francuski biolog Jean Comandon, który jest często uważany za pioniera mikrokinematografii. Comandon, mikrobiolog specjalizujący się w badaniach nad kiłą, użył ogromnej kamery kinowej przykręconej do ultramikroskopu, aby zarejestrować ruch bakterii wywołującej kiłę - Treponema pallidium1. Wykazał, że ruch bakterii wywołującej chorobę różni się w sposób wyjątkowy od ruchu bakterii nie wywołującej choroby. W późniejszym czasie stworzył wiele innych biologicznych i medycznych filmów komórkowych, wierząc, że rejestracja ruchu komórek na kliszy może pomóc lekarzom w lepszym zrozumieniu, a nawet diagnozowaniu niektórych chorób.
Co ciekawe, te pierwsze filmy o komórkach były wyświetlane w paryskich kinach, w przerwach między kronikami filmowymi a wiadomościami rozrywkowymi. Filmy te służyły również do nauczania ludzi o komórkach i cząsteczkach; ludzie byli podekscytowani tym, że mogą zobaczyć coś nowego, czego nigdy wcześniej nie widzieli.
Pierwsze filmy z bakteriami i żywymi komórkami były nagrywane w czasie rzeczywistym; jednak wkrótce wykorzystano elastyczną naturę filmu, by poprawić jakość tych wiernych reprodukcji. Wkrótce naukowcy zaczęli stosować mikrokinematografię poklatkową. Ta forma mikrokinematografii polegała na wykonywaniu zdjęć w równych odstępach czasu, a następnie odtwarzaniu ich z większą prędkością, co przyspieszało postrzegane ruchy. Dzięki temu niezauważalne wcześniej powolne zmiany stały się widoczne dla naukowców, co otworzyło nowy obszar zjawisk biologicznych na eksperymenty. W ten sposób mikrokinematografia żywych komórek stała się prekursorem współczesnego obrazowania żywych komórek, napędzając chęć naukowców do zobaczenia więcej, co zaowocowało postępem w dziedzinie mikroskopii i technologii przechwytywania wideo.
Mikroskopia z kontrastem fazowym
Kolejny wielki skok w obrazowaniu komórek nastąpił na początku lat 30. XX wieku, wraz z wynalezieniem mikroskopu z kontrastem fazowym przez Fritsa Zernike. Fizyk teoretyczny z wykształcenia, jego praca z optyką pokazała, jak badania w wysoce wyspecjalizowanej dziedzinie mogą przynieść innowacyjne osiągnięcia w pozornie niezwiązanych ze sobą dyscyplinach. Z pomocą zakładów optycznych Zeiss w Jenie (Niemcy) zaprojektował pierwszy mikroskop z kontrastem fazowym. Wkrótce jednak większość producentów mikroskopów zaczęła produkować własne mikroskopy z tym ulepszonym trybem oświetlenia preparatu. W rzeczywistości mikroskop z kontrastem fazowym okazał się takim postępem w mikroskopii, że Frits Zernike otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 1953 roku.
Do lat 30. XX wieku opracowano wiele technik barwienia, ale wszystkie one wymagały, by preparat był martwy, co ograniczało ich przydatność. Nowy mikroskop pozwolił po raz pierwszy zaobserwować szczegóły komórkowe bez użycia śmiertelnych barwników. Fale świetlne mogą powodować zmianę jasności i fazy ośrodka (np. komórki) oraz nadawać kolory, w zależności od długości użytej fali. Tradycyjny sprzęt fotograficzny i ludzkie oko są wrażliwe na zmiany jasności, ale zmian fazowych nie można dostrzec bez specjalnego sprzętu. Mikroskopia kontrastu fazowego umożliwiła obserwację struktur komórkowych, które do tej pory były niewidoczne w mikroskopach jasnego pola bez użycia barwnika. Rozwój ten umożliwił biologom badanie żywych komórek i ich rozmnażania się w procesie podziału.
Pierwszą rejestrację żywych komórek przy użyciu mikroskopu fazowo-kontrastowego wykonał Kurt Michel, aby przedstawić etapy mejotycznego podziału komórek w żywych komórkach. W 1941 r. zaczął on nawet dokumentować proces mitotyczny związany z podziałem komórek za pomocą zdjęć poklatkowych. Nowoczesne obiektywy z kontrastem fazowym można łączyć z technikami wzmacniania kontrastu w celu dalszej poprawy obrazowania komórek. Mogą one również zmieniać poziom absorpcji otaczającego oświetlenia w celu uzyskania szerokiego spektrum kontrastu preparatu i intensywności tła.
Kamera cyfrowa i nowoczesne techniki obrazowania
Kolejna rewolucja w obrazowaniu żywych komórek nastąpiła wraz z wynalezieniem samodzielnego aparatu cyfrowego. Wynaleziony w 1975 roku przez Steve'a Sassona z firmy Kodak, oferował doskonałą jakość obrazu, łatwość obsługi oraz większą elastyczność w przechowywaniu i obróbce zdjęć.
Pod koniec lat 80. aparat cyfrowy przyczynił się do powstania wielu nowych technik obrazowania, które zmieniły nasze rozumienie procesów zachodzących w komórkach. Należą do nich takie techniki, jak mikroskopia szerokopolowa (WFM), laserowa mikroskopia konfokalna i techniki obrazowania fluorescencyjnego (FRET, TIRF, FRAP i FLIP). Te nowe techniki obrazowania pozwoliły naukowcom na analizę ruchu i interakcji partnerów białkowych wewnątrz pojedynczych żywych komórek.
Mikroskopia szerokopolowa (WFM)
WFM umożliwia oświetlenie całej próbki na statywie mikroskopu2. Jest to najprostszy i najtańszy sposób obrazowania żywych komórek, idealnie nadający się do monowarstw komórek lub cienkich plasterków. Jako źródła światła wykorzystuje się zwykle łukowe lampy rtęciowe i ksenonowe, choć ostatnio zaczęto stosować diody elektroluminescencyjne (LED). Procedury postprocesowe, takie jak dekonwolucja, mogą zapewnić konfokalną jakość obrazów cienkich próbek przy ułamku kosztów.
Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM)
W CLSM, która jest standardem w każdym laboratorium obrazowania, wykorzystuje się lasery o różnej długości fali do obrazowania niewielkiego obszaru próbki, tworząc obraz piksel po pikselu poprzez zbieranie emitowanych fotonów2. Główną zaletą tej metody jest to, że do badania można wybrać zdefiniowane przez użytkownika obszary zainteresowania, co eliminuje konieczność skanowania całej próbki. Co więcej, CLSM umożliwia uzyskanie optycznych przekrojów próbki, wykluczając znaczną część fluorescencji tła, która może być nieostra.
Obrazowanie fluorescencyjne
Obecnie stosuje się wiele różnych technik obrazowania fluorescencyjnego. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), zwana również mikroskopią fali ewanescencyjnej, wykorzystuje unikalne właściwości indukowanej fali ewanescencyjnej lub pola jako środka do selektywnego wzbudzania fluoroforów komórkowych bezpośrednio przy powierzchni komórki3. Co więcej, może ona również ograniczyć interferencję leżących poniżej regionów w obrębie komórki lub jej struktury. Ponieważ wiele kluczowych zdarzeń zachodzi w bezpośredniej bliskości powierzchni błony, technika ta może znacznie zwiększyć liczbę uzyskanych obrazów i informacji wysokiej jakości.
Lokalizacja fluorescencji po fotobełkotaniu (FLAP) umożliwia śledzenie cząsteczek w żywych komórkach dzięki wykorzystaniu zlokalizowanego fotoznakowania3. Śledzona cząsteczka otrzymuje dwa fluorofory, kontrolny i docelowy, które są szybko fotobielone w wybranym miejscu. Pozwala to na lokalizację rozmieszczenia cząsteczek poprzez proste różnicowanie obrazów i umożliwia scharakteryzowanie ruchliwości cząsteczek komórkowych.
Wartość innowacji w dziedzinie obrazowania żywych komórek na przestrzeni dziejów zwiększa globalna pandemia Covid-19 i nieodłączne zapotrzebowanie na narzędzia, które pomogą nam lepiej zrozumieć i leczyć choroby.
LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokiej jakości specjalistycznych etykietoraz dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w instytucjach opieki zdrowotnej.
Referencje:
- Lorusso L, Lefebvre T, de Pastre B. Jean Comandon Neuroscientist. J Hist Neurosci. 2016;25(1):72-83.
- Cole R. Obrazowanie komórek na żywo. Cell Adh Migr. 2014;8(5):452-9.
- Dunn, G. A. et al. Fluorescence localization after photo bleaching (FLAP): a new method for studying protein dynamics in living cells. Journal of Microscopy 205, 109-112, 2002.
